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血液中单个核细胞的分离视频(高效离心管使用)

发布:2021-10-14  更新:2023-04-13

血液裂红后的流式图VS经样本密度分离液分离后的流式图:

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血液中单个核细胞的分离要点:

一.抗凝剂的选择

1.分离出的PBMC需要进行下一步细胞培养(如培养NK、CIK细胞):选择肝素抗凝剂。由于血浆中的纤维蛋白原活化成有活性的纤维蛋白,纤维蛋白交联成纤维蛋白血凝块,易使PBMC形成细胞团块,不利于细胞的活化。肝素钠抗凝剂可减轻上述情况发生几率。

2.分离出的PBMC无需培养,而是用于其他检测:选择枸橼酸钠抗凝剂,分离效果最佳。

二.对血液的要求

PBMC最佳分离时间为血液离体后2小时内。如达不到2小时内分血条件,请务必于4小时内进行分血步骤,超过4小时很难顺利进行分离。

血液离体时间

分离效果

2小时内

最佳

2-4小时

可接受

4-6小时

细胞活性下降,分离效果不佳

6小时以上

分离效果极差,直至分离不出细胞

三.分离液的使用环境

1.分离液需常温(37℃-15℃)避光保存,严禁冷藏冷冻保存;

2.使用时严格遵守无菌操作规范,并在18℃-22℃环境温度下进行操作,20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围,有可能使分离液密度发生改变,造成分离效果不佳。

四.血液样本稀释方法

1.稀释方法:1份的PBS或生理盐水加2份的血液进行稀释(PBS:抗凝血=1:2);

2.稀释液要求:用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。

五.各种规格离心管的使用方法

1.15ml离心管(包括高效离心管):

1)最佳比例:5ml分离液 + 4ml稀释过的血液

2)最佳离心条件:20℃环境下,500g离心25min

3)离心机使用时调整为慢升慢降(具体参数请咨询离心机厂家)

建议升速(指开始启动→达到设定离心力)的时间、降速(指设定离心时间完成→机器完全停止)时间均控制在3分钟左右。

2.50ml离心管(包括高效离心管):

1)最佳比例:20ml分离液 + 20ml稀释过的血液

2)最佳离心条件:20℃环境下,650g离心30min

3)离心机使用时调整为慢升慢降(具体参数请咨询离心机厂家)

建议升速(指开始启动→达到设定离心力)的时间、降速(指设定离心时间完成→机器完全停止)时间均控制在3分钟左右。

3.未经稀释的抗凝血分离方法细胞培养、或需保存血浆推荐用此方法):

使用50ml离心管(或50ml高效离心管)

1)50ml普通离心管最佳比例:20ml分离液 + 20ml抗凝血;

50ml高效离心管最佳比例:15ml分离液 + 20ml抗凝血;

2)最佳离心条件:20℃环境下,600g离心30min;

3)获得纯度较高的血浆:离心后,吸取血浆层由上至下的2/3处血浆,下1/3处血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分。

使用15ml离心管(或15ml高效离心管)

1)15ml普通离心管最佳比例:5ml分离液 + 5ml抗凝血;

15ml高效离心管最佳比例:4ml分离液 + 5ml抗凝血;

2)最佳离心条件:20℃环境下,600g离心25min;

3)获得纯度较高的血浆:离心后,吸取血浆层由上至下的2/3处血浆,下1/3处血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分;

4)若采血量较少,需小量分离,分离液的量不得少于3ml,抗凝血量在0.2-3ml之间。

转自:https://mp.weixin.qq.com/s/SvYm5neIZip_7HgN-f-KHw