小鼠  干细胞  骨髓  

小鼠骨髓间充质干细胞分离液KIT

品牌：天津灏洋/TBD点击下载说明书

储存：常温保存，有效期2年。启封后置常温保存

本产品用于分离小鼠骨髓间充质干细胞(C57小鼠红细胞容易出现红细胞沉降不完全，请慎重选择！)

【产品规格】

200ml/Kit

【产品组成】 为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】

1.适用仪器

最大离心力可达1200g的水平转子离心机

2.无菌硅化离心管

【骨髓单细胞悬液的制备】

1.   以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。

2.   用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液（产品编号：F2013TBD）冲洗出内 腔中的骨髓。

3.   收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以 70μm 细胞筛网（产品编号：TBDTM-SC，需要另购）过滤。

4.   450g，离心 10min，弃上清。

5.   用样本稀释液（产品编号：2010C1119）重悬细胞浓度为 2×10⁸–1×10⁹/ml 的单细胞悬液 备用（以小鼠为例，一般使用 1ml 样本稀释液重悬骨髓细胞）。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。

1.   取一支离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液最少不得少于3ml）。

2.   用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-550g，离心 20-30min。（注： 根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间 越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。

3.   离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色目 的细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

4.   用吸管小心吸取第二层环状乳白色目的细胞层到另一 15ml 离心管中，向离心管中加入

5-10ml 洗涤液（产品编号：TBDTM-W），混匀细胞。

5.   400g，离心 10min。

6.   弃上清。

7.   用吸管以 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.   250g，离心 10min。

9.    重复 7、8、9，弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

【注意事项】

1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最 好在取样 2h 内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过 6h 后 分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2.  本实验最好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

3.  吸取过多的目的细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒 细胞数量增加。

4.  分离液用量大于骨髓单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。

5.  如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】 本实验干细胞提取率大于 80%。

【可能存在的问题及解决方法】

1.   由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.   本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。

3.   本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g 为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。

技术文档编号：TBD0030SOP 版本日期：2024.04.29