猫  组织  NK细胞  

猫组织NK细胞分离液试剂盒

品牌：天津灏洋/TBD点击下载说明书

储存：常温保存，有效期2年。启封后置常温保存

【包装规格】
2×200ml/Kit

【产品组成】

【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达1200g 的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在3 分钟左右。）

2.   实验最佳分离时间

为获得最佳的实验结果，最好在取样  2h    内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

3.   分离液的使用环境

a. 分离液需常温（15℃-25℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在20℃-25℃环境温度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

4.   无菌离心管

5.  参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于    80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞，请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃（试剂需要复温。夏季20℃，冬季25℃。）的条件下进行。

【脏器组织单细胞悬液的制备】

1. 取组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将脏器组织剪成小块。

2. 将组织块放在70µm 细胞筛网(品牌：Falcon，货号：352350 需要另购)上，用研磨器反复揉搓，边揉搓边加入匀浆冲洗液(以0.1g 组织为例，约加5-8ml)，使细胞全部通过筛网冲到离心管中。

注：需要让细胞形成单个的细胞悬液冲到离心管中，而不是被揉搓研磨挤压到离心管中。目的：使脏器组织形成单个的细胞，而不是成团或碎片组织。单个的细胞更易分离。

3. 弃去筛网，组织研磨液经300-400g，离心10min，弃去上清。

4. 用组织样本稀释液重悬组织细胞，将细胞悬液细胞浓度调整为2×10⁸--1×10⁹/ml (以0.1g 组织为例，约使用0.5-1ml 组织样本稀释液重悬细胞)，备用。

注：A.多个动物脏器组织需要分离时，应逐个单独进行，不可同时混合进行揉搓研磨。

B. 用组织样本稀释液重悬组织细胞时，以小鼠或大鼠为例，约使用0.5ml 或1.0ml 组织样本稀释液重悬细胞。细胞悬液的细胞浓度约为   2×10⁸--1×10⁹/ml。

C. 若发现匀浆冲洗液冲洗的细胞粘度较大，可进行以下处理：

①配置新冲洗液：4 份的匀浆冲洗液加1 份的胰蛋白酶/EDTA 消化液（品牌：天津灏洋/TBD，编号：TE2004Y    需另购）进行稀释，配置为新冲洗液。

②离心管预处理：再研磨开始之前，在离心管中加入  0.5-1ml    胎牛血清，进行保护和终止胰蛋白酶/EDTA 消化液。

③再进行2,3,4 实验步骤即可。

根据脏器组织样本单细胞悬液的量，分以下两种情况：

情况A：样本细胞悬液量0.5-1.5ml 时，实验方法如下：

1.取一支10ml 无菌硅化离心管，先加入3ml 分离液1，后缓慢加入1.5ml 分离液2，形成梯度界面，再缓慢吸取0.5-1.5ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（分离液试剂总量不得少于4ml，样本细胞悬液不得多于1.5ml。总液体量不得超过2/3）。

2.以450g ，离心30min。

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白色NK 细胞层(第一层白环及上层50%分离液2)。第三层为环状乳白色单个核细胞层(下层50%分离液2 及第二层白环)。第四层为透明分离液1 液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色NK 细胞层转移到新离心管B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管C 中。

5.向含有NK 细胞的离心管B 中，加入5-10ml 洗涤液（品牌:  天津灏洋/TBD，编号：TBDTM-W），混匀细胞。

6.400g，离心10min。弃去上清。

7.用吸管吸取5ml 清洗液（品牌:  天津灏洋/TBD，编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.250g，离心10min，弃去上清。

9.重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（品牌:  天津灏洋/TBD，编号：2010X1118）或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

情况B：样本细胞悬液量2.0-3.0ml 时，实验方法如下：

1.取一支15ml 无菌离心管，先加入5ml 分离液1，后缓慢加入2ml 分离液2，形成梯度界面，再缓慢吸取  2-3ml    样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。

（总液体量不得超过2/3）。

2.以600g ，离心30min。

3. 离心后，此时离心管中由上至下分为六层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳白色NK 细胞层(第一层白环及上层50%分离液2)。第三层为环状乳白色单个核细胞层(下层50%分离液2 及第二层白环)。第四层为透明分离液1 液层。第五层为粒细胞层。第六层为红细胞和组织细胞碎片层。

4.①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色NK 细胞层转移到新离心管B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管C 中。

5.向含有NK 细胞的离心管B 中，加入5-10ml 洗涤液（品牌:  天津灏洋/TBD，编号：TBDTM-W），混匀细胞。

6.400g，离心10min。弃去上清。

7.用吸管吸取5ml 清洗液（品牌:  天津灏洋/TBD，编号：2010X1118）重悬所得细胞。

8.250g，离心10min，弃去上清。

9.重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（品牌:  天津灏洋/TBD，编号：2010X1118）或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】

情况一：NK细胞层和单个核细胞层混在一起不能分开

1.吸取全部白色环状细胞层，清洗后用组织样本稀释液1-2ml 重悬细胞。

2.使用分离液2 重新提取NK 细胞。

3.取15ml 离心管，加入4ml 分离液2，将用组织样本稀释液重悬的1-2ml 细胞缓慢加于分离液之液面上，400g，离心 20min。

4.离心后，离心管可分为4 层，第一层组织稀释液层，第二层NK 细胞层，第三层分离液层，第四层单个核细胞层。

5.可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得NK 细胞。

【注意事项】

1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，最好在取样2h 内进行实验，样本存放时间越长，细胞分离效果越差。样本放置超过6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

3. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】

本实验NK 细胞提取率大于80%。

【可能存在的问题及解决方法】

1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.离心机离心力、转速、半径的换算方法

3.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。

4. 本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以  50-100g    为基数，直至达到最佳分离效果，离心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。离心时间以20-30min 为准。

备注：TBD0039SOP，2023.0111-1