大鼠  外周血  白细胞  

大鼠外周血白细胞分离液试剂盒

品牌：天津灏洋/TBD点击下载说明书

储存：常温保存，有效期2年。启封后置常温保存

【包装规格】
200ml/Kit
【产品组成】 
为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【实验前准备】
1.    适用仪器
最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。
（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达 到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。）
2.    抗凝剂的选择 在动物实验采血时，很多实验者选择医用真空采血管获得抗凝血，医用采血管中的抗凝剂只考虑血浆质量，但不利于高纯度细胞分离实验（或必须使用枸橼酸钠的医用真空抗凝采 血管）
为此，天津灏洋特别开发出专用实验动物抗凝剂及抗凝管专用于细胞分离，改变使用普 通采血管获得抗凝血分离效果不佳，提取率及纯度低下的不良结果。

3.    目的细胞最佳分离时间
血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。

4.    分离液的使用环境
a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；
b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。
5.    无菌离心管

6.    参考值（目的细胞参考范围）
本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于    80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 25℃。）的条件下进行。
血液样本需要稀释时，实验方法如下：
稀释方法：1 份的 PBS 或样本稀释液(产品编号：2010C1119)加 2 份的血液进行稀释
（PBS:抗凝血＝1:2）； 注：稀释液要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。 
根据血液样本，分以下两种情况：
情况 A：血液样本量 0.5-2.0ml 时，实验方法如下：
1.    取一支 10ml 无菌硅化离心管，加入 4ml 分离液，再缓慢加入 0.5-2.0ml 血液样本。血液 样本小心加于分离液液界面之上。（分离液不得少于  3ml，血液样本不得少于  0.5ml）
2.    以 450g ，离心 30min。（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力及离 心时间。）
3. 离心后，离心管中由上至下分为五层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色白细胞层。 第三层为环状乳白色白细胞层（可能会有少量红细胞混杂）。第四层为透明分离液层。 第五层为红细胞层。
注：离心管可能分为四层，第二层和第三层可能混淆在一起，全部取出即可。
4.    ①小心吸取血浆层转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的第一层环状乳白色白细胞层转移到新离心管 B 中。
③小心吸取离心管中的第二层环状乳白色白细胞层转移到新离心管 B 中。
5.    向含有（大/小鼠）白细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118）， 混匀细胞。
6.    400g，离心 10min。弃去上清。
7.    用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
8.    250g，离心 10min，弃去上清。
9.    重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例

情况 B：血液样本量 2.0-4.0ml 时，实验方法如下：
1.    取 15ml 的无菌离心管，小心加入 5ml 分离液，加入血液样本量 2.0-4.0ml。血液样本小 心加于分离液界面之上。（总液体量不得超过  2/3）
2.    以  500g，离心  30min。（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大， 离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。）
3. 离心后，离心管中由上至下分为五层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色白细胞层。 第三层为环状乳白色白细胞层（可能会有少量红细胞混杂）。第四层为透明分离液层。 第五层为红细胞层。
注：离心管可能分为四层，第二层和第三层可能混淆在一起，全部取出即可。
4.    ①小心吸取血浆层转移到新离心管 A 中。
②小心吸取离心管中的第一层环状乳白色白细胞层转移到新离心管 B 中。
③小心吸取离心管中的第二层环状乳白色白细胞层转移到新离心管 B 中。
5.    向含有（大/小鼠）白细胞的离心管 B 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118）， 混匀细胞。
6.    400g，离心 10min。弃去上清。
7.    用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
8.    250g，离心 10min，弃去上清。
9.    重复清洗两次，弃去上清，用  0.5ml    清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步实 验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。
分离图例

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】
情况一：白细胞层混杂红细胞
1.    吸取有红细胞混杂的白细胞层。
2.    取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的白细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍红 细胞裂解液。
a.    如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：NH4CL2009）将红细胞裂解（具 体方法见“红细胞裂解液使用说明”）即得目的细胞。
b. 参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得白细胞。

【注意事项】
1. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。
2. 分离液用量大于稀释后血液样本时，分离效果更佳。
3. 不当的稀释方法会降低细胞得率及活性。稀释液要求：不含钙镁离子的缓冲液或培养基。 血液样本经过稀释则分离过程中需适当降低离心力和离心时间。
4. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持。
【储存条件及有效期】
常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】 本实验白细胞提取率及大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。
 

【可能存在的问题及解决方法】
1.    由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.    离心机离心力、转速、半径的换算方法

3.    本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。
4.    本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以  50-100g    为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。
备注：2023.0107-4