大鼠  中性粒细胞  骨髓  

大鼠骨髓中性粒细胞分离液试剂盒

品牌：天津灏洋/TBD点击下载说明书

储存：常温保存，有效期2年。启封后置常温保存

【包装规格】

200ml/Kit

【产品组成】

为方便广大用户使用，试剂内容如下：

​【实验前准备】

1.   适用仪器

最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机。

（离心机使用时调整为慢升慢降（具体参数请咨询离心机厂家）建议升速（指开始启动→达到设定离心力）的时间、降速（指设定离心时间完成→机器完全停止）时间均控制在 3 分钟 左右。

2.   实验最佳分离时间

为获得最佳的实验结果，最好在取样  2h    内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效 果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

3.   分离液的使用环境

a. 分离液需常温（15℃-25℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生 改变，造成分离效果不佳。

4.   无菌离心管

5. 参考值（目的细胞参考范围）

本试剂盒可保证目的细胞的提取率大于    80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞， 请配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃， 冬季 25℃。）的条件下进行。

【骨髓单细胞悬液的制备】
1. 大（小）鼠等小型实验动物以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头 两端，露出内腔。用注射器吸取适量(根据动物大小)的匀浆冲洗液(产品编号：F2013TBD) 冲洗出内腔中的骨髓。

2. 收集骨髓悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以 70µm 细胞筛网(产品编号：TBDTM-SC，需要另购)过滤。

3. 以 450g，离心 10min，弃上清。

4. 用红细胞沉降液重悬细胞浓度为 2×10⁸- 1×10⁹/ml 的单细胞悬液备用(以小鼠为例，一般 使用 1ml 红细胞沉降液重悬骨髓细胞)。

根据骨髓单细胞悬液的量，分以下两种情况：
情况 A：样本细胞悬液量 0.5-1.5ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 10ml 无菌硅化离心管，先加入 3ml 分离液 1，后缓慢加入 1.5ml 的 80%浓度的 分离液溶液(分离液 1：组织样本稀释液=4：1 的混合液)，形成梯度界面。

2. 再缓慢吸取 0.5-1.5ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（分 离液试剂总量不得少于 4ml，样本细胞悬液不得多于 1.5ml。总液体量不得超过 2/3）。

3. 以 450g ，离心 30min。

4. 离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳 白色单个核细胞层    。第三层为环状乳白色中性粒细胞层（可能会有少量红细胞混杂）。 第四层为透明分离液液层。第五层为红细胞层。

5. ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色中性粒细胞层转移到新离心管 C 中。

6. 向含有中性粒细胞的离心管 C 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混 匀细胞。

7. 400g，离心 10min。弃去上清。

8. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

9. 250g，离心 10min，弃去上清。

10. 重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步 实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例

​情况 B：样本细胞悬液量 2.0-3.0ml 时，实验方法如下：

1. 取一支 15ml 无菌离心管，先加入 5ml 分离液 1，后缓慢加入 2ml 的 80%浓度的分离液 溶液(分离液 1：组织样本稀释液=4：1 的混合液)，形成梯度界面。

2. 再缓慢吸取 2-3ml 样本细胞悬液加于分离液液面之上。各液面分层一定要清晰。（总液 体量不得超过 2/3）。

3. 以 600g ，离心 30min。

4. 离心后，此时离心管中由上至下分为五层。第一层为组织稀释液层。第二层为环状乳 白色单个核细胞层。第三层为环状乳白色中性粒细胞层（可能会有少量红细胞混杂）。 第四层为透明分离液液层。第五层为红细胞层。

5. ①小心吸取组织稀释液层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色单个核细胞层转移到新离心管 B 中。

③小心吸取离心管中的环状乳白色中性粒细胞层转移到新离心管 C 中。

6. 向含有中性粒细胞的离心管 C 中，加入 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混 匀细胞。

7. 400g，离心 10min。弃去上清。

8. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

9. 250g，离心 10min，弃去上清。

10.  重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）或根据下一步 实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例​

【分离过程中可能出现的情况及处理方案】

情况一：中性粒细胞层混杂红细胞（方法一）

1. 吸取有红细胞混杂的中性粒细胞层。

2. 取 15 毫升离心管加入红细胞混杂的中性粒细胞层，根据红细胞残余数量酌情加入 5-8 倍 红细胞裂解液。

a. 如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液（产品编号：NH4CL2009）将红细胞裂解（具 体方法见“红细胞裂解液使用说明”）即得目的细胞。

b. 参考红细胞裂解液说明书操作。少时多次裂解后获得中性粒细胞。

情况一：中性粒细胞层混杂红细胞（方法二）

1. 吸取红细胞混杂的中性粒细胞层，清洗后用红细胞沉降液 1-2ml 重悬细胞。

2. 取 15ml 无菌离心管，加入 5ml 分离液 1，将用红细胞沉降液重悬的 1-2ml 细胞缓慢加于 分离液之液面上，400g，离心 20min。

3. 离心后，离心管可分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色中性粒细胞 层。第三层为透明分离液液层。第四层为红细胞层。

4. 可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得中性粒细胞。

情况二：单个核细胞层和中性粒细胞层混在一起不能分开

1.  吸取全部白色环状细胞层，清洗后用组织样本稀释液 1-2ml 重悬细胞。

2.  使用分离液 1 提纯。

3.  取 15ml 离心管，加入 5ml 的 80%浓度的分离液溶液(分离液 1：组织样本稀释液=4：1 的混合液），将用组织样本稀释液重悬的  1-2ml    细胞缓慢加于分离液之液面上，400g， 离心 20min。

4.  离心后，离心管可分为四层，第一层组织稀释液层，第二层单个核细胞层，第三层分离 液层，第四层中性粒细胞层。

5.  可重复检验方法中的目的细胞洗涤方法，获得中性粒细胞。

【注意事项】

1. 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心 管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会 变成毛面，影响细胞分离效果。

2. 分离液用量大于骨髓单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。

3. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助。

【储存条件及有效期】

常温保存，有效期  2    年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启 封后置常温保存。如   4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】

本实验中性粒细胞提取率大于 80%。

【可能存在的问题及解决方法】

1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2. 离心力换算公式

3. 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地 区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离 心时间，对离心转速进行调整。

4. 本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可 能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以  50-100g    为基数，直至达到最佳分离效果， 离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。

备注：2023.0103-2