分离出的 PBMC 需要进行下一步细胞培养（如培养 NK、CIK 细胞）：选择肝素抗凝剂。

由于血浆中的纤维蛋白原活化成有活性的纤维蛋白，纤维蛋白交联成纤维蛋白血凝块，易使PBMC形成细胞团块，不利于细胞的活化。肝素钠抗凝剂可减轻上述情况发生几率。分离出的PBMC无需培养，而是用于其他检测：选择枸橼酸钠抗凝剂，分离效果最佳。

3. PBMC 最佳分离时间

血液离体后 2 小时内。如达不到 2 小时内分血条件，请务必于 4 小时内进行分血步骤，超过 4 小时很难顺利进行分离。

4. 分离液的使用环境

a. 分离液需常温（37℃-15℃）避光保存，严禁冷藏冷冻保存；

b. 使用时严格遵守无菌操作规范（超净工作台或生物安全柜内），并在 18℃-22℃环境温 度下进行操作，20℃条件下分离效果最佳。超出此温度范围，有可能使分离液密度发生改变，造成分离效果不佳。

5. PBMC 高效离心管（详见 PBMC 高效离心管使用说明）

6. 参考值（目的细胞参考范围）

本试剂可保证目的细胞的提取率大于80%，不是纯度。如需获得高纯度目的细胞，请 配合免疫磁珠分选。本试剂盒可减少磁珠的使用量，减少成本。

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃（试剂需要复温。夏季 20℃，冬季 23℃）的条件下进行。
血液样本需要稀释时，实验方法如下：

稀释方法：1 份的 PBS 或样本稀释液(产品编号：2010C1119 需另购)加 2 份的血液进行稀释（PBS:抗凝血＝1:2）；

注：稀释液要求：用不含钙镁离子的缓冲液或培养基进行血液稀释。

稀释图例

各种规格离心管的使用方法（推荐最佳方法）

取一支无菌离心管，加入分离液，后缓慢加入血液样本或新鲜抗凝血。血液样本或 新鲜抗凝血小心加于分离液液界面之上。（若采血量较少，需小量分离，分离液的量不 得少于 3ml，抗凝血量在 0.2-3ml 之间）
1.15ml 离心管（包括高效离心管）：

A. 最佳比例：5ml 分离液+ 4ml 稀释过的血液；

B. 最佳离心条件：20℃环境下，500g 离心 25min。

2.50ml 离心管（包括高效离心管）：

A. 最佳比例：20ml 分离液+ 20ml 稀释过的血液；

B. 最佳离心条件：20℃环境下，650g 离心 30min。

未经稀释的抗凝血分离方法（细胞培养、或需保存血浆推荐用此方法）：

3.使用 15ml 离心管（或 15ml 高效离心管）：
A. 15ml 普通离心管最佳比例：5ml 分离液+ 5ml 抗凝血；

B. 15ml 高效离心管最佳比例：4ml 分离液+ 5ml 抗凝血；

C. 最佳离心条件：20℃环境下，600g 离心 25min。

注：获得纯度较高的血浆：离心后，吸取血浆层由上至下的 2/3 处血浆，下 1/3 处血浆可能包含部分 PBMC 及少量分离液成分；

4.使用 50ml 离心管（或 50ml 高效离心管）：

A. 50ml 普通离心管最佳比例：20ml 分离液+ 20ml 抗凝血；

B. 50ml 高效离心管最佳比例：15ml 分离液+ 20ml 抗凝血；

C. 最佳离心条件：20℃环境下，600g 离心 30min。

注：获得纯度较高的血浆：离心后，吸取血浆层由上至下的 2/3 处血浆，下 1/3 处血浆可 能包含部分 PBMC 及少量分离液成分。

实验后续方案

1. 离心后，离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色（人）淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

2. ①小心吸取血浆层转移到新离心管 A 中。

②小心吸取离心管中的环状乳白色（人）淋巴细胞层转移到新离心管 B 中。

3. 向含有（人）淋巴细胞的离心管 B 中，加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118 需另购）， 混匀细胞。

4. 250g，离心 10min。弃去上清。

5. 用吸管吸取 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118 需另购）重悬所得细胞。

6. 250g，离心 10min，弃去上清。

重复清洗两次，弃去上清，用 0.5ml 清洗液（产品编号：2010X1118 需另购）或根据下一步实验要求加入相对应液体，重悬所得细胞。

分离图例